实操合并VCF文件的几种方法及注意事项背景在基因组分析领域的很多不同场景中，需要合并VCF文件VCF文件简单来说，就是记录样本基因型的文件但多数VCF文件不只记录了基因型，也包含有关该基因型的来源的细节其它文件VCF文件的上游是BAM文件。
背 景
在基因组分析领域的很多不同场景中，需要合并VCF文件。
VCF文件。简单来说，就是记录样本基因型的文件。但多数VCF文件不只记录了基因型，也包含有关该基因型的来源的细节。
其它文件。VCF文件的上游是BAM文件，主要记录Reads与参考基因组的比对信息；更上游的，就是FASTQ测序数据，以及物种的参考基因组。
不同类型的VCF文件。VCF文件有单样本的、多样本的；也有普通vcf文件 (只记录变异，未测到的、野生型的都不记录)，及GVCF文件 (野生型的、变异的都记录，未测到的不记录)。
一个典型的GVCF文件
因此，本篇文章的使用者，需要首先了解GVCF文件与普通VCF文件的不同。因为二者对应的生信处理方法也非常不同。但具体有哪些不同，这里不再继续讲，可自行在网络资源上按照相应的关键词检索。
合并VCF文件需要注意的问题。VCF文件有时是多个样本、多个个体、或多个病例的合并；有时是不同染色体区域的VCF合并。上述每个场景都涉及不同的软件、程序，甚至算法，需要非常小心、谨慎地操作。
合并：不同样本的GVCF文件
GATK的CombineGVCFs GenotypeGVCFs
上面2个程序是一套组合，不可拆分，不可单独使用。
那为什么GATK开发者将二者分开呢，推测有两个原因：① 二者分别有些特定的参数；② 第1个程序非常耗时，第2个程序相对较快、但算法复杂。这个问题对使用者也无关紧要。
#合并队列中每个样本的每一个变异(GVCF文件)gatk CombineGVCFs \-R $ref \$(foriin`tail-n 2metadata.txt|cut-f1`;doecho"--variant${i}.hg38.raw.g.vcf";done)\-Ocohort.g.vcf.gz#获取具体基因型，完成变异CallinggatkGenotypeGVCFs \-R$ref\--dbsnp${dbSNP}\--variantcohort.g.vcf.gz\-OGenotype.cohort.dbSNP.g.vcf
当样本很多、数据量也大时，CombineGVCF程序很消耗内存，并且一旦中断（文件不全）就得重新来。其"-L"参数 (如"-L chr1:1-10000") 也不推荐使用 (否则GenotypeGVCFs步骤可能报错)，但"-L chr1"没问题。
解决方法：① 限制内存：用"--java-option Xmx20g"等；② 分染色体，用"-L chrX"等。③ 组合使用①和②。
需要了解的是，GenomicsDB可以替代：CombineGVCFsGenotypeGVCFs，将多个样本GVCF处理生成一起的工作空间。两种方案各有各的优缺点。
根据GATK官网的描述，GenomicsDB更适用于几百个样本以上的情形。
合并：不同染色体区域的VCF文件
cat chr.list.25 # chr1# chr2#chr3# ...# chr22# chrX# chrY#chrMgatk MergeVcfs \$(for i in `cat chr.list.25 | cut -f 1 `; do echo "-I Genotype.cohort.${i}.dbSNP.g.vcf " ;done) \-OGenotype.cohort.dbSNP.g.vcf
MergeVcfs与CombineGVCFs不同。前者用于单纯地合并：样本相同、位点独立的VCF文件。如：同一个(或一组)样本的不同染色体的结果。
不像CombineGVCFs，MergeVcfs不做"gVCF block"的计算。此外MergeVcfs会检测两个VCF文件里的样本名是否相互"match"。
如果只查看MergeVcfs程序的介绍，根本看不出来它的用法的特点 (例如：对GVCF文件的合并可能无效)，那么必然容易踩坑：
MergeVcfs (Picard) - Combines multiple variant files into a single variant file.
事实上，MergeVcfs及其等价的程序 (GatherVcfs) 不可用于合并不同样本的GVCF文件。但用来合并不同基因组区域的文件非常方便。
此场景除了MergeVcfs、GatherVcfs外的其它程序：
vcf-concatsample1.chr1.vcfsample.chr2.vcf...>sample1.chrAll.vcfbcftoolsconcatsample1.chr1.vcfsample.chr2.vcf...-osample1.chrAll.vcf
其中，通过conda安装的vcftools，可能不带vcf-concat等程序。从这一点看，bcftools更方便。
1个经验是：既然有GATK的MergeVcfs可用，那就尽量不用vcftools或bcftools，否则可能踩到另一个坑：不同程序对VCF文件的索引格式的要求不同、VCF的"FORMAT"列等也可能改变。
合并：不同样本的普通VCF文件
普通VCF文件只记录变异，即：① 无0/0基因型 (测序测到了、但未变异，即"Wild type") ；② 无"./."基因型 (即"缺失"，测序未测到，即"No call") 。
对不同样本的⽂件合并，共有位点会合并、统计；非共有位点若在某1个样本中无变异，则会⾃动记为缺失 ("./.") 。
1个典型的普通VCF文件 (只查看了第9、10列)
vcftools和bcftools在使用之前一般都需要对VCF文件：压缩、索引 (略)。
vcf-merge#略 (对于连软件安装都麻烦的程序)bcftoolssample1.vcfsample2.vcf...-osample.all.vcf
vcf-merge重新计算了AC、AN等指标的值
合并分型质量 ("QUAL"列) 时，vcf-merge取了平均取值，bcftools取了最⼤值， (下图的)gatk CombineVariants (不是CombineGVCFs，也不是MergeVcfs/GatherVcfs)取了最⼩值 (gatk4)
图片来源：https://wenku.baidu.com/view/a0ecad5602f69e3143323968011ca300a7c3f643.html
gatk CombineVariants (GATK4已无此程序)
# 压缩、索引单个VCF文件lssorted.*.vcf|whilereadid;do bcftools view $id -Oz -o $id.gz bcftools index $id.gzdone#合并bcftoolsmerge--threads8-mid-Ozsorted.*.vcf.gz\-obcftools.merged.103samps.vcf.gz #-m,--merge(关于多等位基因)Allowmultiallelicrecordsfor<snps|indels|both|all|none|id>,seemanpagefordetails[both] # -O, --output-type <b|u|z|v> 'b' compressed BCF; 'u' uncompressed BCF; 'z' compressed VCF; 'v' uncompressed VCF [v]# gVCF参数（可能不适用于gVCF文件）：# -g, --gvcf <-|ref.fa> merge gVCF blocks, INFO/END tag is expected. Implies -i QS:sum,MinDP:min,I16:sum,IDV:max,IMF:max#测试某个位点# zcatbcftools.merged.103samps.vcf.gz|grep'112626'#有返回结果。但无DP等信息# 索引合并后的文件bcftoolsindexbcftools.merged.103samps.vcf.gz&
bcftools merge虽然有"--gvcf"参数，但根据之前的测试，可能不适用于对gVCF文件的合并。
总 结
总之，① 合并VCF文件要区分其文件类型，如：是否为gVCF文件，是否为基因组的不同区域，其内部的样本名称等；② 考虑到整个流程的兼容性和流畅性，建议当GATK有相应的工具时，优先使用之；③ 其它场景可依次考虑：bcftools、vcftools。
